الگتروفورز

لینک دانلود و خرید پایین توضیحات

فرمت فایل word و قابل ویرایش و پرینت

تعداد صفحات: 17

الکتروفورز

مروزه الکتروفورز شاید اصلی ترین تکنیک برای جداسازی ملکولها در آزمایشگاه‌های سلولهای زیستی است. زیرا تکنیک قدرتمندی است و هنوز به طور معقولانه ای آسان و ارزان است و خیلی آسان و پیش پا افتاده شده است. علی رغم بسیاری از آرایش های فیزیکی برای دستگاه ها و صرف نظر از محیطی که ملکولها اجازه مهاجرت در آن دارند جداسازی با الکتروفورز به توزیع بار در ملکولی که جداسازی می شود بستگی دارد. الکتروفورز می تواند یک بعدی یا دو بعدی باشد. الکتروفورز یک بخشی برای جداسازی اغلب پروتئین‌های روتین و اسید نوکلئیک استفاده می شود. بخش دوم الکتروفورز برای جداسازی پروتئین هایی که در اثر انگشت هستند استفاده می شود. محیط کمکی برای الکتروفورز می تواند در ژل در لوله یا در ورقه های صاف خوابیده تشکیل شود لوله ها برای جداسازی یک بعدی استفاده می شوند و زمانی که ورقه ها فضای سطحی بلندی را اشغال می کنند برای جداسازی دو بعدی بهترند. شکل 1-4 نوعی واحد الکتروفورز ورقه ای تخت را نشان می دهد. زمانی که دیترجنت SDS سدیم دو دسیل سولفات با پروتئین ها استفاده می شود، همه پروتئین ها دارای بار منفی می شوند به وسیله وابستگی به آنیون سدیم دودسیل سولفات در زمان جدا سازی با ژل پلی آکریلامید طرز عمل و رویه با پلی آکریلامید ژل الکتروفورز خلاصه می شود این تکنیک برای تعیین وزن مولکولی استاندارد شده است. ژل های پلی آکریلامید از پلیمریزه کردن دو ترکیب تشکیل شده اند. آکریلامید و N , N متیلن بیس آکریلامید.

بیس در اینجا عامل پیوند دهنده برای ژل هاست. پلیمریزاسیون با اضافه کردن آمونیوم پرسولفات در زمانی که همچنین دی متیل آمینوپرپیونیتریل یا N , N , N , N تترامتیل اتیل اندیامین آغاز می شود. ژل ها خنثی و هیدروفیل هستند و شبکه سه بعدی از هیدروکربن های طولانی که به وسیله گروه های متیلن به هم وصل شده اند تشکیل شده است جداسازی ملکول ها در ژل بستگی به اندازه منفذها و سوراخهای تشکیل شده در ژل دارد. اندازه سوراخهای ژل به وسیله دو فاکتور تعیین می شوند. %T که مقدار درصد آکریلامید را نشان می دهد. %30 که مقدار درصد پیوند دهنده را نشان می دهد. هر چه مقدار کل آکریلامید افزایش یابد اندازه منفذ ژل کاهش می یابد. پیوند دهنده های با 5% C کوچکترین اندازه منفذ را می دهد. هر افزایش یا کاهش در %C باعث افزایش در اندازه منفذ می شود. کل آکریلامید داده شده بعنوان نسبت درصد وزن به حجم از آکریلامید+بیس آکریلامید است.

پروتئین ها با وزن مولکولی در محدوده ده هزار یا یک میلیون با 2/71% ژل های آکریلامید جداسازی می شوند. زمانی که پروتئین ها با وزن ملکولی بالاتر نیازمند تمرکز ژل آکریلامید پایین تر هستند برعکس ژل های 30% برای جداسازی پلی پپتیدهای کوچک استفاده می شود.

تمرکز بیشتر ژل باعث کوچکتر شدن اندازه منفذ ژل و جداسازی بهتر ملکولهای کوچک می شود. درصد ژل مورد استفاده بستگی به وزن مولکولی پروتئین مورد جداسازی دارد.

ژل های 5درصد برای پروتئین هایی در محدوده 60000 تا 200000 دالتون استفاده می شوند. ژل های ده درصد برای پروتئین های 16000 تا 70000 دالتون استفاده می شوند و ژل های پانزده درصد برای پروتئین های 12000 تا 45000 دالتون استفاده می شوند.

سیستم های کاتیونی و آنیونی

در الکتروفورز پروتئین ها در یک بار پایه جداسازی می شوند و بار پروتئین می تواند مثبت یا منفی باشد.بسته به PH بافر. در عملیات معمولی ستون حاوی ژل قیمت بندی شده در سه قسمت شامل: 1- ژل جدا کننده 2- ژل توده شده 3- ژل نمونه . ژل نمونه ممکن است حذف بشود و نمونه از طریق غلیظ شدن محیط غیر هدایتی مانند ساکاروز به وجود بیاید. الکترودها به دو انتهای ستون متصل می شوند و جریان الکتریکی از طریق ژل جزءبندی شده عبور می کند. اگر الکترودها به صورت بالا آرایش پیدا کنند حمام بالایی کاتد و حمام پایین آند (+) است.

آنیون ها اجازه دارند که به سمت آند بروند و به این سیستم آنودی می گویند. کاتیون ها اجازه دارند که به سمت کاتد بروند و به این سیستم کاتدی می گویند.

سیستم های لوله ای و ورقه ای

در طراحی پروتکل الکتروفورز دو سیستم نزدیک به هم طراحی شده است یکی ستون الکتروفورز که از ژلهای لوله مانند در لوله های شیشه ای تشکیل شده است و دیگری ژل های تخت که از ژل تخت بین دو صفحه شیشه ای تشکیل شده است. مزایای ژل های تیوبی در حرکت ملکولها از طریق ژل ها کمتر مستعد و مهیاست تا حرکت افقی و بنابراین گسترش آرامی در تجزیه و تحلیل باندها به خصوص در پروتئین ها وجود دارد و از نظر اقتصادی هم به صرفه است زیرا نسبتا آسان است برای ساختن این سیستم می توان در خانه از مواد قابل دسترس استفاده کرد. با وجود اینکه ژل های تخت مزایایی دارند که اجازه می دهند برای تجزیه های دو بعدی از آنها استفاده شود جدا کردن چندین نمونه به طور همزمان در یک ژل وجود دارد. ژل های تخت طوری طراحی شده اند که چندین راه باریک دارند که نمونه ها به طور موازی حرکت کنند. اندازه و تعداد راه ها می تواند مختلف باشد زمانی که نمونه ها در یک محیط حرکت می کنند کمترین همانندی نمونه های مختلف منجر به تغییرات جزئی در ساختار ژل می شود. ژل تخت تکنیکی برای تجزیه های لکه‌ای و تجزیه های اتورادیوگرافیک